Актуальность. NK-клетки, или естественные киллеры, занимают промежуточное положение между врожденным и адаптивным иммунитетом, регулируя иммунный ответ за счет своих цитолитических свойств и способности продуцировать разнообразные цитокины. Участие NK-клеток в иммунопатогенезе аутоиммунных заболеваний бесспорно, но к настоящему времени их роль до конца не раскрыта и остается противоречивой. Данное исследование направлено на разработку методических подходов и стратегии анализа субпопуляций NK-клеток в качестве прогностических и предиктивных маркеров эффективности терапии и прогноза течения у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа.

Материалы и методы. Мы разработали многоцветные панели для проточной цитометрии с целью анализа субпопуляций NK-клеток в периферической крови пациентов с сахарным диабетом 1-го типа у детей и взрослых. Проанализировано 65 детей и 12 взрослых пациентов. Анализ проводили на проточном цитометре LSRFortessa (BD Bioscience, США) с ПО Diva. В каждом образце анализировали 5000 событий в целевом гейте лимфоцитов. Использовали моноклональные антитела к следующим антигенам: CD3, CD19, CD16, CD56, CD8, CD4, CD161, TCR Va24-Ja18, TCR Va7.2-Jα33, CD38, EOMES, NKG2A, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, CD95. Измеряли следующие субпопуляции NK-клеток: тотальные NK-клетки, регуляторные NK-клетки, цитокин-продуцирующие NK-клетки, промежуточные NK-клетки, эффекторные NK-клетки, цитолитические NK-клетки, незрелые NK-клетки. Также субпопуляции NK-T-клеток, в том iNKT и ассоциированные со слизистой оболочкой инвариантные Т-клетки, MAIT. Во всех субпопуляциях NK- и NK-T-клеток оценивали ко-экспрессию активационных CD38, EOMES и ингибирующих молекул — CD161, NKG2A. Регуляторный статус устанавливали по экспрессии контрольных точек иммунитета: PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT. Цитотоксический потенциал оценивали по продукции гранзима В и перфорина. Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPadPrism 8 (GraphPad Software, США).

Результаты. Разработаны многоцветные панели для проточной цитометрии и предложены стратегии многоступенчатого гейтирования субпопуляций NK- и NK-Т-клеток в периферической крови. Получены данные по частоте встречаемости в периферической крови мажорных и минорных субпопуляций NK- и NK-Т-клеток в периферической крови пациентов с сахарным диабетом 1-го типа у детей и взрослых. Выявлены закономерности экспрессии функциональных маркеров. Определены корреляционные зависимости между частотой различных субпопуляций с различным функциональным статусом и стажем заболевания, осложнениями в виде кетоацидоза, уровнем аутоантител, количеством С-пептида.

Заключение. На данном этапе исследования показана зависимость клинических и иммунологических показателей у больных сахарным диабетом 1-го типа. В зависимости от стадии заболевания и взаимодействия с другими иммунными клетками, NK-клетки, обладающие цитотоксическими и регуляторными свойствами, могут являться обоюдоострым звеном иммунной системы, вызывая противоположное действие. Установленные закономерности, безусловно, требуют подтверждения бо́льшим количеством наблюдений.