Актуальность. Популяционные исследования клинических случаев предполагают наличие ассоциаций между ВДКН и развитием опухолей надпочечников [1]. Дефицит 21-гидроксилазы, опосредованный наличием мутаций в гене CYP21A2, является причиной развития врожденной дистрофии коры надпочечников (ВДКН) в 90–95% случаев. Ген CYP21A2 расположен внутри RCCX локуса на коротком плече 6-й хромосомы, содержащего более чем в 65% случаев псевдоген CYP21A2. Из-за гомологии между геном и псевдогеном около 96–98% сложность при анализе мутаций в гене CYP21A2 существенно возрастает. Высокая достоверность результатов генетического анализа является важнейшим фактором для диагностики и терапии патологических состояний, ассоциированных с геном CYP21A2.

Материалы и методы. С помощью метода ПЦР, с использованием набора LongAmp Taq PCR Kit, NEB амплифицировали участок 6179 bp (NC_000006.12), включающий в себя целевой полный ген CYP21A2, с праймеров CYP749f (AGGTGCTCCTGGTGGCTAAAGG) и Tena36F2 (AGGCGCTCGCTATGAGGTGAC). ПЦР-продукт очищали согласно инструкции производителя с применением магнитных частиц AMPure XP (Beckman Coulter). Очищенный ПЦР-продукт использовали для постановки сиквенсовой реакции и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Cиквенсовую реакцию проводили с помощью BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit с 8 внутренних праймеров, универсальных для гена CYP21A2 и псевдогена CYP21A2P, перекрывающих кодирующие области гена CYP21A2. ПЦР-РВ использовали для детекции 9 частых мутаций (rs9378251, rs6475, rs6471, rs6445, rs7755898, rs7769409, rs12530380, rs1554299737, rs6476) с помощью собственной разработанной тест-системы на основе технологии TaqMan-зондов и 5x qPCRmix-HS (Евроген).

Результаты. Благодаря универсальности праймера CYP749f, расположенного в 5’-области перед геном CYP21A2 и псевдогеном CYP21A2P, и специфичности праймера Tena36F2, расположенного в 35 экзоне гена TNXB, в ходе ПЦР амплифицируется только участок локуса RCCX, предположительно содержащий транслируемую версию гена CYP21A2. При этом для анализа доступны химерные варианты с крупными делециями между геном и псевдогеном. Достоверность анализа 10 групп сибсов подтверждена методом секвенирования по Сэнгеру. Результаты, полученные методом ПЦР-РВ с использованием TaqMan-зондов на 84 образцах, согласуются с данными, полученными методом секвенирования по Сэнгеру в 100% случаев.

Заключение. Разработанные методики секвенирования по Сэнгеру и ПЦР-РВ с применением TaqMan-зондов позволяют обнаруживать мутации в транслируемых вариантах гена CYP21A2 как в норме, так и в случаях конверсий между геном и псевдогеном, либо в случаях крупных делеций с образованием химерных вариантов. Ограничением методик является неспособность детектировать аллели с крупными делециями, затрагивающими область отжига праймеров CYP749f или Tena36F2.