Фенотип NK-клеток после культивирования in vitro в присутствии фидерных клеток

Актуальность. Современные подходы лечения онкологических больных, включают в себя методы иммунотерапии, основанные на адоптивном переносе больному аутологичных или аллогенных клеточных препаратов на основе активированных T-лимфоцитов или NK-клеток. Для эффективной активации и экспансии NK-клеток необходимо длительное культивирование, которое может включать ко-стимулирующие факторы (цитокины, антитела) и/или фидерные клетки. Целью данного исследования явилась оценка пролиферативной активности и иммунофенотипа NK-клеток здоровых доноров в процессе длительной экспансии.

Материалы и методы. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови 10 условно здоровых доноров по стандартной методике и кокультивировали с фидерными клетками линии TMDK-562-15 в течение 20 дней в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением ИЛ-2 (ронколейкин, «БИОТЕХ», Россия) во флаконах, в условиях СО2 -инкубатора при температуре 37о С. Подсчет клеток и жизнеспособность осуществляли на автоматическом анализаторе TC10 (BioRad, Сингапур) каждые 10 дней. Индекс пролиферации (ИП) определяли как отношение общего числа клеток на 20 день к количеству клеток до начала культивирования. Цитофлуориметрический анализ проводили на 0, 10 и 20 дни экспансии на проточном цитометре с визуализацией Image Stream MkII («Luminex», США). Применяли 6-цветную панель меченых антител к СD45/3/56/16 и маркерам активации CD38/HLA-DR («BD Biosciences», США). Статистический анализ осуществляли с помощью «MS Excel 2016».

Результаты. Средний ИП NK-клеток на 20 день культивирования составил 106. В процессе экспансии происходила перегруппировка основных популяций NK- и T-клеток. На 20 день культивирования среднее содержание NK-клеток увеличилось в 11 раз до 86,7% (p<0,05), а Т-клеток снизилось в 6 раз до 12,8%. При этом более 70% NK-клеток имели фенотип CD56+CD16+, также наблюдалось увеличение экспрессии маркеров активации CD38+ и HLA-DR+ до 97,3% и 94,5% соответственно, что подтверждает процесс активации in vitro. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Показано, что длительное культивирование мононуклеарных клеток в присутствии цитокина и фидерных клеток позволяет многократно увеличить количество и долю активированных NK-клеток. Данную технологию можно использовать для производства клеточного продукта и получения CAR-NK-клеток.> ˂ 0,05), а Т-клеток снизилось в 6 раз до 12,8%. При этом более 70% NK-клеток имели фенотип CD56+CD16+, также наблюдалось увеличение экспрессии маркеров активации CD38+ и HLA-DR+ до 97,3% и 94,5% соответственно, что подтверждает процесс активации in vitro.

Заключение. Показано, что длительное культивирование мононуклеарных клеток в присутствии цитокина и фидерных клеток позволяет многократно увеличить количество и долю активированных NK-клеток. Данную технологию можно использовать для производства клеточного продукта и получения CAR-NK-клеток.