Разработка тест-системы для обнаружения химерных генов (RET- ССDС6, RET- NCOA4, ETV6-NTRK3) при дифференцированных формах рака щитовидной железы

Актуальность. Рак щитовидной железы (ЩЖ) занимает пятое место в мире по распространенности (Jemal, et al., 2010 г.). Рост заболеваемости почти полностью обусловлен наиболее распространенным гистологическим типом — папиллярным раком ЩЖ (EER Cancer Statistics Review, 2017 г.). Химерные гены слияния играют важную роль как в этиологии, так и в патогенезе рака и рассматриваются в качестве потенциальных диагностических и прогностических маркеров и возможных терапевтических мишеней. Наличие химерных генов — слияний (fusion): RET — ССDC6, RET — NCOA4, ETV6 — NTRK3 в биологических пробах является специфичным для карцином ЩЖ папиллярного типа (Nakazawa T, et al, 2005 г.), в связи с чем обнаружение данных альтераций является достоверным указанием на наличие папиллярного рака ЩЖ. Своевременная и точная диагностика позволит определить причину на начальном этапе проявления заболевания, дифференцировать доброкачественные и злокачественные узлы, лимфомы ЩЖ и метастазы в нее.

Материалы и методы. В качестве биоматериала использовались FFPE-блоки с дифференцированными формами рака ЩЖ. Из FFPE была выделена тотальная РНК, была амплифицирована кДНК с помощью гексамеров. Была проведена кПЦР. Реакционная смесь содержала кДНК, TaqMan-зонды, смесь 1X qPCRmix-HS (Евроген, Россия), прямой и обратный праймеры. TaqMan-зонды подбирались по свечению на участок хромосомной перестройки с участием гена RET (RET/PTC1: [VIC] CCAGCGTKACCATCGAGGATCCA (BHQ2); RET/PIC3: [VIC] AAAGCAGACCTTGGAGAACAGTCAGGAGG (BHQ2); ETV6-NTRK3: [VIC] GCCCATTGGGAGAATAGCAGATGTGC (BHQ2)). Были подобраны специфические праймеры на каждую перестройку RET/PTC1: прямой — 5’ TGCAGGAGGAGAACCG3’, обратный — 5’GAACCAAGTCTCCGAGGGA3’; RET/PIC3: прямой — 5’CCCCAGGACTGGTTACCC3’, обратный — 5’GAACCAAGTCTCCGAGGGA3’; ETV6-NTRK3: прямой  — 5’CTGTCTCCCCGCCTGAAGA3’, обратный — 5’TTCTCGCTTCAGCACGATGT3’. кПЦР проводили в амплификаторе QuantStudio 5 (Thermo Scientific, США) по программе: 95 °C в течение 5 мин, 40 циклов при 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 10 с, 72 °C в течение 10 с. Для внутреннего контроля прохождения ПЦР использовали прямой и обратный праймеры, TaqMan-пробу для измерения уровня экспрессии гена GAPDH (эндогенный контроль).

Результаты. Выделенная РНК из FFPE всех образцов имела индекс DV200 более 50%. Амплификация целевого гена наблюдалась в канале VIC/JOE. Результаты регистрировались как отрицательные, если не было сигмоидальной кривой и >35, и как положительные, если была сигмоидальная кривая с ˂ 35. Положительные образцы были повторно проверены секвенированием по Сэнгеру с прямого и обратного праймера, все химерные гены подтвердились. У проб с отрицательным контролем (mQ) не было обнаружено сигмоидальной кривой. Во всех образцах на 30–32 циклах поднимался GAPDH. Перестройка RET/PTC1 была обнаружена в трех образцах. Перестройка RET/PTC3 была обнаружена в трех образцах. Перестройка ETV6-NTRK3 была обнаружена в одном образце.

Заключение. Было подтверждено, что у пяти из шести пациентов с перестройками была диагностирована папиллярная карцинома, и у одного фолликулярная аденома. Полученные результаты показывают, что разработанная тест-система с достаточно высокой точностью (100%) может выявлять экспрессию химерных генов — слияний (fusion): RET- ССDС6, RET- NCOA4, ETV6-NTRK3.

1. EER Cancer Statistics Review, 1975–2014. Bethesda: National Cancer Institute; 2017

2. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer Statistics, 2010

3. Nakazawa T, et al. RET gene rearrangements (RET/PTC1 and RET/PTC3) in papillary thyroid carcinomas from an iodine‐rich country (Japan) // Cancer: Interdisciplinary International Journal of the American Cancer Society. – 2005. – Т. 104. – №5. – С. 943–951