Современные возможности применения стероидного профиля мочи для диагностики адренокортикального рака

ОБОСНОВАНИЕ

Стероидный профиль мочи (СПМ) является одним из показателей физиологической деятельности надпочечников, яичек и яичников человека. В связи с особенностями секреции стероидных гормонов (например, цикличность в различные часы суток, повышение концентрации в стрессовых ситуациях) оптимальным способом определения СПМ является суточный сбор и дальнейшее исследование аликвоты суточной мочи пациента. Нарушения СПМ отмечаются при отклонениях в развитии, половом созревании и патологии надпочечников (первичном гиперальдостеронизме, гиперкортицизме, врожденной гиперплазии коры надпочечников и адренокортикальном раке) [1, 2]. Измерение СПМ возможно производить несколькими методами, среди которых лидирующее положение занимают высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ — LC-MS/MS — Liquid chromatography-mass spectrometry) и газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС — GC-MS — Gas chromatography-mass spectrometry). Оба метода обладают своими достоинствами и недостатками, при этом основным преимуществом ГХ-МС является возможность проведения единовременной оценки всего спектра стероидов (до 60 показателей). К недостаткам ГХ-МС можно отнести достаточно сложные процедуры пробоподготовки и проведения исследования, ограничивающие его применение в рутинной диагностической лаборатории. Подобных недостатков лишен метод ВЭЖХ, однако с его применением возможно проведение одновременного исследования достаточно ограниченного числа стероидов.

Новообразования надпочечников являются достаточно распространенной и чрезвычайно разнородной группой заболеваний. Среди них наибольшую угрозу представляет адренокортикальный рак (АКР). Важную роль в определении злокачественной природы новообразований надпочечников играют лучевые методы исследования. КТ и МРТ позволяют проводить предоперационную диагностику АКР, устанавливать стадию и распространенность злокачественного процесса. Чувствительность и специфичность этих методов оценивается авторами в 93–99,8% [3–6] и 83,1–98,6% соответственно [7–9]. Вместе с тем, при высокой диагностической эффективности современных лучевых методов диагностики опухолей надпочечников, для постановки точного клинического диагноза также необходимо проведение гормональных исследований.

Исследование СПМ у пациентов с диагностированными новообразованиями надпочечников предназначено в первую очередь для подтверждения или опровержения АКР. Наличие риска злокачественного поражения надпочечника является ключевым моментом в выборе дальнейшей тактики лечения. В случае подтверждения АКР пациенту показано безотлагательное оперативное лечение. Также исследование СПМ может быть значимо для диагностики отдаленных метастазов АКР после хирургического удаления первичной опухоли надпочечника. При этом в вопросе точности и значимости исследований СПМ в медицинском сообществе к настоящему времени накопилось достаточное количество разногласий. С одной стороны, имеется ряд работ, доказывающих строгую ассоциацию изменений СПМ у пациентов с АКР по нескольким паттернам стероидогенеза [1, 10–12]. В противоположность этому, существует мнение о не столь значимой роли изменения СПМ для диагностики новообразований надпочечников [13–15]. Основными доводами сторонников данной точки зрения являются чрезвычайная морфологическая и функциональная гетерогенность новообразований надпочечников, повышенные требования к эксперту в плане трактовки изменений концентрации метаболитов, а также отсутствие достоверности в ее определении.

ЦЕЛЬ

Настоящее исследование направлено на определение границ точности определения СПМ для диагностики АКР.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Характеристика исследования:

• одноцентровое;
• проспективное;
• выборочное;
• неконтролируемое.

Критерии соответствия

В исследование включены все пациенты независимо от пола и возраста, у которых по данным обследования (КТ брюшной полости) выявлены новообразования надпочечников. Не включались в исследование пациенты с феохромоцитомами, метастатическим поражением надпочечников, мезенхимальными опухолями и кистами надпочечников.

Условия проведения

Все пациенты проходили лечение в отделении эндокринной хирургии Клиники высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова Санкт-Петербургского государственного университета (КВМТ СПбГУ).

Продолжительность исследования

Исследование происходило в период с 2016 по 2018 гг. без смещения запланированных временных интервалов.

Описание медицинского вмешательства

Всего исследовались 58 пациентов с новообразованиями надпочечников. Для дальнейшего анализа из 58 пациентов были отобраны 30 с адренокортикальными аденомами (n=17) и АКР (n=13), у которых был изучен СПМ. В дальнейшем сопоставление результатов определения СПМ методом ГХ-МС и морфологического исследования образцов новообразований проводилось независимо. 28 больным была выполнена адреналэктомия, двум пациентам проведена биопсия (хирургическое лечение не проводилось в связи с распространенностью опухолевого процесса). Всем пациентам была произведена гистологическая верификация диагноза с оценкой злокачественного потенциала по критериям Weiss (2001) и применением иммуногистохимического (ИГХ) исследования. Диагноз АКР устанавливался при наличии более 5 баллов при световой микроскопии и ИГХ-признаков злокачественного роста. Прогноз рецидива опухоли оценивался по ИГХ (Кi 67).

Методика определения СПМ производилась по нижеприведенной схеме. Проводился забор суточной мочи пациентов. Из суточного объема отбиралась аликвота в 100 мл и замораживалась при –80 °С. В дальнейшем проводился забор 2 мл мочи через подготовленные прогонкой 4 мл метанола и 2 мл воды картриджи SepPak (Waters, USA) со скоростью 0,15 мл/мин. Дальнейшие стадии пробоподготовки включали добавление стандартов, гидролиз, водную экстракцию и дериватизацию стероидов с применением триметилсилил имидазола. Следующие этапы — экстракция, вторичная дериватизация и определение уровня стероидов проводились, как описано в методике Н. Тейлора [3]. Качественное и количественное изменение стероидного профиля с определением паттернов, характерных для АКР, оценивалось экспертом (профессор Норман Тейлор, Лондон, Медицинский факультет Королевского Колледжа).

В целях оценки информативности стероидного профиля проводилось определение чувствительности, специфичности и точности методики для диагностики адренокортикальной карциномы. Предшественники адреналового стероидогенеза, изученные в анализируемой группе пациентов, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Показатели стероидного профиля мочи, оцениваемые у пациентов с новообразованиями надпочечников

Основной исход исследования

Оценивались показатели диагностической эффективности СПМ для диагностики АКР: точность, специфичность и чувствительность.

Анализ в подгруппах

Пациенты были разделены на 2 подгруппы в зависимости от наличия у них злокачественного новообразования надпочечника: адренокортикальных аденом (n=17) и АКР (n=13).

Методы регистрации исходов

Для оценки стероидного профиля мочи использовался масс-спектрометр Shimadzu 2060. Хирургическое лечение пациентов проводилось с использованием эндовидеохирургической техники Karl Storz (Германия).

Этическая экспертиза

Протокол Комитета по биомедицинской этике Клиники высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова (N 12/15, подписан 14.12.15 г.). При проведении этической экспертизы по представленным документам замечаний нет. Одобрено проведение исследования на базе Клиники высоких медицинских технологий им. Н.И. Пирогова.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. При анализе данных использована статистическая программа Microsoft Exсel (компания Microsoft, США). Концентрации стероидов фиксировались в электронной базе данных. В дальнейшем оценивалась диагностическая эффективность методики определения СПМ для диагностики АКР: точность, чувствительность, эффективность.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

Всего исследовались 62 пробы у 58 пациентов с новообразованиями надпочечников. Исследование носило характер слепого проспективного. Для дальнейшего анализа из 58 пациентов были отобраны 30 с адренокортикальными аденомами (n=17) и АКР (n=13), у которых был изучен СПМ. Необходимо отметить, что при изучении стероидного профиля диагноз известен не был, и сопоставление результатов определения СПМ методом ГХ-МС и морфологического исследования образцов новообразований проводилось независимо. Распределение по полу: 10 мужчин и 20 женщин. Средний возраст составил 46,8±12,7 года (24–70 лет). 28 больным была выполнена адреналэктомия, двум пациентам проведена биопсия (хирургическое лечение не проводилось в связи с распространенностью опухолевого процесса). Клинические и лабораторно инструментальные данные фиксировались в истории болезни и в дальнейшем заносились в электронную базу данных. Всем пациентам была произведена гистологическая верификация диагноза с оценкой злокачественного потенциала по критериям Weiss (2001) и применением ИГХ-исследования.

Основные результаты исследования

Критериями злокачественного преобразования опухоли надпочечника служили нарушения паттерна масс-спектров комплекса стероидов, выявляемых методом ГХ-МС (рис. 1, 2). Основным показателем злокачественного преобразования опухоли является увеличение концентрации тетрагидро-11-дезоксикортизола (THS), дегидроэпиандростерона, прегнен-3β,16α,20α-триола, прегнен-3α,16α,20α-триола, прегнандиола, прегнантриола и прегнентриола в моче (табл. 2).

Рисунок 1. Пример стероидного профиля суточной мочи больного аденомой надпочечника (20.98 – 11 охоАе; 22.64 – 11А; 24.12 – Р2; 24.71 – Р3; 28.73 – THE; 30.00 – THF).

Рисунок 2. Пример стероидного профиля суточной мочи больного адренокортикальным раком (АКР: 24.10 – Р2; 24.70 – Р3; 25.33 – dР2; 26,35 – THS; 28.33 – dР3; 30.01 – THF).

Таблица 2. Концентрация исследованных стероидов, показавших наибольшие отличия в различных группах пациентов, мкг/л

Как следует из нашего исследования (табл. 3), наиболее достоверными маркерами АКР становится повышение концентрации THS (2 случая) и дегидроэпиандростерона (2 случая) или их сочетание (1 наблюдение). Таким образом, нарушения их соотношения с другими стероидами отмечаются в 5 случаях из 13 проанализированных (38,5%).

Таблица 3. Изменения в стероидном профиле мочи, выявленные экспертом у больных АКР

Одним из ключевых диагностических критериев при анализе СПМ является соотношение концентраций прегнандиола (Р2) и прегнантриола (Р3). Подобная картина является хорошим маркером АКР у мужчин и женщин в постменопаузе. У женщин репродуктивного возраста увеличение концентрации Р2 и Р3 может быть обусловлено фазой менструального цикла.

Наиболее востребованной для настоящего исследования была оценка диагностической эффективности изучения СПМ для диагностики АКР. В результате из 13 случаев гистологически подтвержденных АКР только 6 (46,2%) продемонстрировали паттерн СПМ с характерными изменениями. В оставшихся 7 случаях (53,8%) достоверных биохимических признаков злокачественного перерождения тканей надпочечников не было выявлено (табл. 3, 4).

Таблица 4. Результаты изучения стероидного профиля мочи в группе пациентов с адренокортикальным раком (n=13) для определения канцерогенеза

Интересен анализ СПМ, когда новообразования надпочечников оказывались доброкачественными опухолями. Из 17 случаев в 12 (70,6%) продемонстрировано четкое отсутствие маркеров АКР, а в пяти наблюдениях (29,4%) были выявлены сомнения, которые не позволили достоверно исключить злокачественную опухоль (табл. 5). Такие результаты были расценены как ложноположительные (табл. 6).

Таблица 5. Изменения в стероидном профиле мочи, выявленные экспертом у пациентов с аденомой надпочечника

Таблица 6. Результаты изучения стероидного профиля мочи в группе пациентов с аденомами надпочечника (n=17) для определения прогноза канцерогенеза

В целом в изучаемой группе больных (n=30) чувствительность и специфичность в диагностике АКР составляет 46,2 % и 70,6% соответственно. Точность методики была определена, как 60%.

Дополнительные результаты исследования

Дополнительных результатов не отмечено.

Нежелательные явления не отмечены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В целом исследование демонстрирует значительно меньшую ассоциацию стероидных маркеров АКР в СПМ с гистологически подтвержденным диагнозом в каждом конкретном случае. Несмотря на то что некоторые из стероидных маркеров АКР подтверждают часть случаев, общая картина не позволяет поставить точный диагноз, опираясь только на данные ГХ-МС.

Обсуждение основного результата исследования

Подобные критерии также описаны ранее в исследованиях Taylor N., 2013 и Velikanova et al., 2016 [16–18]. Основным показателем является увеличение концентрации THS в моче.

По данным ряда исследований было выявлено повышение уровня THS при развитии злокачественных новообразований коркового слоя надпочечников [19, 20]. Данное вещество является продуктом метаболизма 11-дезоксикортизола, прямого предшественника кортизола. Увеличение концентрации THS в моче при канцерогенезе может быть связано с нарушением функции 11β-гидроксилазы. Это митохондриальный фермент из суперсемейства цитохрома Р450, преимущественно локализованный в митохондриях клеток пучковой зоны коры надпочечников. Его функцией является добавление гидроксильной группы к 11-деоксикортизолу и 11-деоксикортикостерону в позиции 11-го атома углерода, в результате чего образуются кортизол и кортикостерон соответственно. При прекращении или нарушении функционирования данного гена происходит накопление 11-дезоксикортизола, который затем метаболизируется в THS и его стереоизомер 5α-allo-THS и выводится с мочой. При сохранении функций 11β-гидроксилазы происходит свободный синтез кортизола и его дальнейший метаболизм до кортизона при участии гидроксистероиддегидрогеназы 11β. В дальнейшем эти оба стероида метаболизируются до тетрагидро-восстановленных производных: тетрагидрокортизола (THF) и тетрагидрокортизона (THE) и их 5α-стереоизомеров (allo-ТHF и allo-ТHЕ соответственно). Метаболизм снижает биологическую активность гормонов и увеличивает их растворимость в воде путем преобразования их в гидрофильные соединения, которые могут выводиться с мочой. Именно THF и THE преобладают в нормальном стероидном профиле.

В целом в изучаемой группе больных (n=30) чувствительность и специфичность в диагностике АКР составляют 46,2% и 70,6% соответственно. Точность методики была определена как 60%.

В результате исследования произведено уточнение критериев злокачественности при изучении СПМ методом ГХ-МС. До настоящего момента наиболее точным критерием злокачественности новообразования надпочечников считалось увеличение экскреции с мочой THS. В работе Kerkhofs et al. (2015) демонстрируется 100% чувствительность данного показателя при 99% специфичности [10]. Более осторожная оценка приводится Velikanova et al. (2016) [18]. Специфичность увеличения концентрации в моче только THS, без учета дополнительных параметров, составляет 74,2%. На первое место по значимости этими авторами выводятся сочетание увеличения концентраций THS или DHA, а также его метаболитов 17-dA2, 16-OH- DHA и dA3, и значительного смещения соотношения 3α,16,20dP3/3β,16,20dP3 в сторону 3β,16,20dP3. Поэтому при анализе СПМ различными методами необходимо проводить детектирование и сравнительную оценку концентрации различных 5-ен-прегненов: 16-ОН-прегненолон (16dP), 21-ОН-прегненолон (21dP), 21-OH-прегнендиол (21dP2), 11-гидроксипрегнентриол. Помимо вышеперечисленных, в качестве маркеров АКР исследователями отмечается достаточно обширный список стероидов, таких как этиохоланолон, 16-оксо-андростендиол, прегнандиол, прегнантриол (Р3), 11-оксо-Р3, 6β-ОН-прегнанолон, прегнендиол (dP2), 3α,17,20-прегнентриол (3αdP3), 3β,17,20-прегнентриол (3βdP3), 5-ен-прегненов 16dP и 21dP [10, 20]. Авторами было отмечено, что рассматривать изменения паттерна стероидного профиля следует только в комплексе, выявляя совместные колебания уровней различных компонентов. Подобный подход не позволяет исключить субъективность описываемой методики, связанную с условиями проведения анализа и интерпретацией результата.

В качестве важной особенности стероидогенеза следует отметить выявленное во многих случаях повышение уровня Р2 и Р3 у женщин репродуктивного возраста. Несмотря на то что данные показатели являются маркерами АКР для мужчин и женщин в постменопаузе, их наличие в суточной моче может быть обусловлено характером синтеза в половых железах в зависимости от фазы менструального цикла. Это также зачастую затрудняет интерпретацию спектрограмм (см. табл. 5), особенно в случаях с доброкачественными аденомами надпочечника (отмечено в 2 из 17 наблюдений – 11,8%).

Ограничения исследования

Ограничением метода является его субъективность, связанная с тем, что интерпретация методики сложна и доступна лишь специалистам с чрезвычайно высокой квалификацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование показало низкую чувствительность (46,2%) и невысокую точность (60%) определения СПМ как метода первичной диагностики АКР. Особенно это видно по сравнению с лучевыми методами диагностики. Интерпретация методики сложна и доступна лишь специалистам с чрезвычайно высокой квалификацией, что затрудняет распространение и широкое применение этого метода обследования в клинической практике. Вместе с тем определение СПМ в перспективе (после дополнительного изучения) может быть использовано как вспомогательный метод диагностики, в ряде случаев определяющий лечебную тактику у пациентов, перенесших адреналэктомию по поводу АКР.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовом обеспечении Санкт-Петербургского государственного университета.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

Участие авторов. Концепция и дизайн исследования — Иванов А.В., Краснов Л.М., Русаков В.Ф., Черников Р.А., Федотов Ю.Н., Щербаков И.Е., Саблин И.В., Слепцов И.В., Реброва Д.В., Уварова М.А.; сбор и обработка материалов — Саблин И.В., Федоров Е.А., Реброва Д.В., Уварова М.А., Иванов А.В.; анализ полученных данных, написание текста — Русаков В.Ф., Щербаков И.Е., Реброва Д.В., Уварова М.А., Иванов А.В., Краснов Л.М.

Благодарности. Авторы выражают благодарность: профессору Норману Тейлору, Лондон, Медицинский факультет Королевского Колледжа.